PBMC复苏总“翻车”，注意这几点细胞活力会更好

Keywords：外周血单个核细胞；人外周血单个核细胞；猴外周血单个核细胞；犬外周血单个核细胞；大鼠外周血单个核细胞；小鼠外周血单个核细胞；兔外周血单个核细胞；猪外周血单个核细胞；猫外周血单个核细胞；豚鼠外周血单个核细胞；金黄地鼠外周血单个核细胞；Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC;

 

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。作为在免疫学、细胞治疗等相关领域中的宝贵原料，却在复苏阶段频繁使人受挫——细胞死亡率高、状态差、结团率高等问题屡见不鲜。因此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，针对PBMC复苏的相关 问题，生成复苏protocol，即IPHASE免疫细胞使用说明书。今天就让我们来详细了解一下PBMC复苏的常见问题及正确复苏流程。

01 外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）复苏的常见问题

PBMC是人体免疫系统的核心成分，包含了T细胞、B细胞等关键免疫细胞。它如同一个“免疫信息宝库”，是揭示疾病机制、评估免疫状态和开发新疗法的关键窗口。然而，PBMC的复苏总是会伴有细胞结团、活性低、状态差等问题，以下为PBMC复苏的常见问题及其解决方案。

 

【问题描述】复苏后，台盼蓝染色下，细胞活率低。

【解决方案】①避免细胞解冻时间多久，冻存管从液氮中取出后，应立即放入37℃水浴锅，顺时针不断轻柔摇晃，控制在2min内融化成冰晶状态，转入同样经37℃预热的培养基中。② 确保冻存时细胞处于最佳状态，使用程序性降温盒进行标准化冻存，并尽量使用新鲜的细胞及合适的冻存液。

 

【问题描述】细胞聚集成团，在镜下聚集成大团块，难以计数，影响后续实验。

【解决方案】使用移液器轻柔地、多次吹散细胞团块。避免用力过猛产生剪切力，损伤细胞。

 

【问题描述】计数结果不准，忽高忽低。

【解决方案】可能是细胞未充分混匀、团块未吹散、台盼蓝染色时间过长或过短等原因造成的。①重悬细胞后，立即取样计数；②确保计数前细胞是单颗粒悬液；③台盼蓝与细胞液按建议比例混合后，在1-2分钟内完成计数，因为染料本身对活细胞也有毒性。

 

【问题描述】冻存PBMC，复苏后细胞亚群比例明显改变。

【解决方案】冻存PBMC复苏后细胞亚群比例是否改变与冻存液的冻存效果有关。冻存效果好的冻存液细胞冻存复苏后活率高，则细胞亚群比例不会发生显著改变。IPHASE推出的PBMC冻存液细胞复苏后活率＞85%，满足后续实验要求。

 

【问题描述】冻存PBMC能否用于细胞分选试验。

【解决方案】不同厂家要求不同，IPHASE生产的PBMC可搭配IPHASE细胞分选试剂盒进行后续分选试验。

 

综上所述，外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）的复苏小tips也极为重要，毕竟合适的复苏流程，是确保细胞状态、进行后续研发的关键！

 

02 外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）的复苏

以下为IPHASE针对上述复苏难题，结合自己免疫细胞专用复苏培养基，生成的一整套包含PBMC在内的免疫细胞详细复苏流程。

 

【试验试剂】

（1）0.4%台盼蓝溶液

（2）免疫细胞复苏培养基(IPHASE Cell Thaw Medium，Cat.NO.：072008.11、072008.12)

注：实验开始前，请将 IPHASE Cell Thaw Medium 置于 37℃恒温水浴锅中预热，备用。

 

【试验流程】

（1）解冻：从液氮罐中取出细胞冻存管，拧松 1/4 管盖释放压力，迅速拧紧并转移到 37℃的水浴中，顺时针轻柔摇动 90~120s，至冻存管中只有极小块碎冰漂浮即可。

注：保持冻存管盖始终处于水浴锅液面以上，以防造成细胞污染。

（2） 转移：从水浴锅中取出冻存管，用 75%酒精对冻存管表面进行消毒，转移至生物安全柜中。 用宽口（可将普通枪头剪去尖头后灭菌）枪头或巴氏吸管将细胞悬液吸出，缓慢滴加至装有 9mL 预热的 IPHASE Cell Thaw Medium 的无菌 15mL 离心管中，并使用预热的 IPHASE Cell Thaw Medium 润洗冻存管 2 次，1mL/次，轻微颠倒混匀。

（3） 计数：吸取适量细胞悬液进行细胞数量和活率的测定（细胞计数仪和手动计数均可）。

（4） 离心：设置离心力 350g，常温离心 5-7min 后，弃上清，切勿接触到细胞沉淀。

（5） 重悬：先使用 1mL 的 IPHASE Cell Thaw Medium 或后续实验培养基轻轻吹打悬浮细胞，再用 IPHASE Cell Thaw Medium 或后续实验所需培养基补齐体积至 10mL。

（6） 二次离心：重复步骤 2.4。

（7） 再重悬：使用 1mL 的 IPHASE Cell Thaw Medium 或其它适宜的培养基轻轻吹打悬浮细胞，再补充适量的培养基调整至适宜的浓度，即可进行后续试验。

注：a.从液氮中取出细胞开始整个复苏操作过程要迅速，避免影响细胞复苏后的活性。

b.为保证复苏效果，请使用 IPHASE Cell Thaw Medium。

c. 为避免对细胞产生机械损伤，整个操作过程尽可能轻柔。

 

经IPHASE工作人员验证，使用IPHASE生产的PBMC及相应免疫细胞，配合IPHASE免疫细胞复苏培养基(IPHASE Cell Thaw Medium，Cat.NO.：072008.11、072008.12)，按照如上操作流程，可得细胞复苏活率在85%以上。

 

实例如下：

03 IPHASE相关产品

IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，除PBMC外，还有如T细胞、B细胞、NK细胞等多种免疫细胞，具体产品信息如下。

产品分类	种属	规格
单个核细胞	人外周血单个核细胞	5/20 million
	猴外周血单个核细胞	5/20 million
	犬外周血单个核细胞	5 million
	大鼠外周血单个核细胞	5 million
	小鼠外周血单个核细胞	5 million
	兔外周血单个核细胞	5 million
	猪外周血单个核细胞	5 million
	猫外周血单个核细胞	5 million
	豚鼠外周血单个核细胞	5 million
	金黄地鼠外周血单个核细胞	5 million
	脐带血单个核细胞	5 million
	动员外周血单个核细胞	5 million
	脾脏单个核细胞	5 million
	骨髓单个核细胞	5 million
CD3+T细胞	人CD3+T细胞	5/20 million
	小鼠CD3+T细胞	1/5 million
CD4+T细胞	人CD4+T细胞	5/20 million
	小鼠CD4+T细胞	1/5 million
CD8+T细胞	人CD8+T细胞	5/20 million
	小鼠CD8+T细胞	1/5 million
CD14+单核细胞	人CD14+单核细胞	2/5 million
	小鼠CD14+单核细胞	1/5 million
CD19+B细胞	人CD19+B细胞	2/5 million
CD56+NK 细胞	人CD56+NK 细胞	2/5 million
CD34+细胞	人外周血CD34+细胞	1 million
	人脐带血CD34+细胞	1 million
	人动员外周血CD34+细胞	1 million
DC细胞	人外周血树突状细胞	1.5 million
巨噬细胞	人外周血巨噬细胞	1.5 million
复苏培养基	免疫细胞复苏培养基	10/30 mL