化妆品控油功效评价之5α-还原酶活性抑制试验

关键词：Ⅰ型5α-还原酶，Ⅱ型5α-还原酶，肝5α-还原酶，睾丸5α-还原酶，睾酮，二氢睾酮，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，非那雄胺，化妆品控油功效，5α-Reductase，5αR1，5αR2，SRD5A1，SRD5A2，Testosterone，Dihydrotestosterone(DHT)，Finasteride

随着化妆品行业的功效细分，功效宣称的规范，消费者对自己皮肤的状态越来越关注，针对不同肤质也会选择不同功效的护肤品。当前，皮肤油腻逐渐成为困扰年轻人的主要问题，消费者对于具有控油功效的化妆品的需求呈现日益增长的趋势。皮肤油腻与皮脂腺细胞过度分泌油脂有关，其中，5α-还原酶（5α-Reductase）是皮肤油脂分泌的一个关键限速酶，其活性与皮脂腺的油脂分泌情况有着紧密的联系。化妆品功效成分如果能够抑制5α-还原酶活性，则能有效地调节皮脂腺细胞的活性，减少油脂的分泌，从而起到控油的作用。因此，5α-还原酶活性抑制试验是评价化妆品控油功效的关键指标。

01    5α-还原酶简介

5α-还原酶（5α-Reductase，5αR）是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白，是雄激素睾酮( Testosterone,T)代谢的关键酶，共包含Ⅰ型（SRD5A1）、Ⅱ型（SRD5A2）和Ⅲ型（SRD5A3）三种同工酶。其中，Ⅰ型5α-还原酶（5αR1）主要分布于肝脏、皮脂腺、汗腺等器官，发挥生理作用的最适pH为6~9；Ⅱ型5α-还原酶（5αR2）主要分布于前列腺、睾丸、附睾、精囊、头皮毛囊等，作用最适pH为5.5；而Ⅲ型5α-还原酶（5αR3）研究较少，其在难治愈的前列腺癌中过度表达。

5αR可在还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 提供电子的条件下将睾酮上4、5位不饱和双键还原，并转化为更具活性的二氢睾酮（Dihydrotestosterone，DHT）。二氢睾酮作为一种比睾酮更强效的雄激素，可加速人皮脂腺细胞的增殖并促使皮脂分泌亢进，易导致皮肤油腻等问题（图1）出现，给人们带来巨大的心理压力, 影响工作与生活。因此，通过抑制5α-还原酶的活性以减少皮脂分泌来评价化妆品控油功效，并将其运用于控油、痤疮等医药健康产品领域，其具有重要的研究价值和广阔的市场前景。

图1 5α-还原酶在皮肤油脂分泌中的作用（来源：基于人5α还原酶活性试验对化妆品控油原料的筛选）

02    5α-还原酶活性抑制试验与化妆品控油功效评价

根据化妆品功效宣称评价项目要求（表1），控油功效宣称评价方法有三种：人体功效评价试验、消费者使用测试和实验室试验方法，配以文献数据支持。其中人体功效和消费者测试这两种方法为人体方法，所需的成本高，周期长。目前市场上认可最多的就是体外实验室试验法，实验室试验认可的方法有：皮脂腺细胞试验和5α-还原酶活性抑制试验。

皮脂腺细胞试验由于细胞的特性，不宜用低毒性或者高于低毒性的化妆品进行检测，易使细胞失去活性。因此：5α-还原酶活性抑制试验是化妆品控油功效评价最常使用的方案。

03    IPHASE相关产品

5α-还原酶活性抑制的体外评估方法通常有紫外法、液相色谱-质谱（LC-MS）法、酶联免疫吸附试验（ELISA）法、放射性同位素法、荧光法等。其中LC-MS法、同位素法和ELISA法灵敏度高，均可准确测定5αR活性，但价格昂贵，对试验人员操作技能要求较高；紫外法虽操作简单，但测定的目标物NADPH对5αR并无专一性，易受到其他酶的干扰而造成检测偏差。

鉴于此，IPHASE技术人员建立了一种基于可见分光光度法的5α-还原酶活性抑制效果体外评估的方法，该方法基于酶循环原理，提高了检测灵敏度和特异性。该方法涉及两步反应，首先5α-还原酶将睾酮代谢为5α-二氢睾酮，接着二氢睾酮在酶的作用下继续反应，此反应过程中生成的产物在405nm波长处有特异性的峰值，通过检测该产物在405nm波长处的吸光度变化，用来体现二氢睾酮生成的多少，最终反映5α-还原酶的活性变化，从而评估化合物的抑制效果（图2）。由于检测产物在405nm处有特异性的吸收峰，因此不受其他物质的吸光度的干扰，提高了检测特异性。

图2 基于可见分光光度法的5α-还原酶活性检测原理

此外，为更好地满足不同客户的需求，IPHASE技术人员在此方法基础上根据5α-还原酶的类型开发出Ⅰ型(SRD5A1)5α-还原酶抑制率评估试剂盒和Ⅱ型(SRD5A2)5α-还原酶抑制率评估试剂盒，可分别用于Ⅰ型5α-还原酶和Ⅱ型5α-还原酶抑制剂的筛选。

两种试剂盒的不同主要体现在酶的来源和阳性药物的选择上，其中，Ⅰ型试剂盒为SD大鼠肝5α-还原酶和度他雄胺（Dutasteride），Ⅱ型试剂盒为SD大鼠睾丸5α-还原酶和非那雄胺（Finasteride）。此外，试剂盒还包括了睾酮T、NADPH溶液、酶制剂及反应缓冲液等成分，以确保用户能够轻松建立反应体系并进行检测。试剂盒中各组成成分经过严格的质量检测，试验结果准确、可靠、重现性好。

IPHASE技术人员对阳性抑制剂非那雄胺的抑制效果进行评估，根据试剂盒说明书进行操作，试验体系中非那雄胺终浓度为62.5ug/ml，睾酮终浓度为5uM，SD大鼠睾丸5α-还原酶终浓度为0.2mg/ml，第一步反应孵育时间为30min，第二步反应的孵育时间为4min。第二步反应后，用酶标仪检测各组别在405nm处的的吸光度值：

按照下列公式进行抑制率的计算：

代入数值，可得出非那雄胺的抑制率为：

注：阳性对照样本的抑制率在70%以上，试验成立。

因此，在试验初期，本试剂盒提供的方法可作为化合物高通量初筛的一种手段，简便、高效，试验结果准确、可靠。

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